Eva Holubová se k herectví dostala během studia na gymnáziu, kdy začala účinkovat v amatérských souborech. Po střední škole pracovala v různých profesích a na DAMU se dostala až napotřetí. V 80. letech, tedy během vysokoškolského studia, se věnovala spíše divadelním hrám než filmovým rolím. Na slavnou kariéru u filmu si musela počkat až do konce 90. let. Zahrála si v řadě slavných českých komedií, jako jsou Knoflíkáři (1997), Pelíšky (1999) či Pupendo (2003). Za ztvárnění postavy Květy Laskoňové ve filmu Ene bene (2000) získala Českého lva. Na ocenění byla nominována i za roli v komedii Účastníci zájezdu (2006), za kterou získala cenu na newyorském filmovém festivalu Tribeca.
